第一作者：凌云云
通讯作者：夏云生，肖乐辉
通讯单位：安徽师范大学、南开大学
研究亮点：
1. 制备了一种各向异性、二维飞碟状的AuNP@MnO2超级纳米粒子（由Au纳米球和二维MnO2纳米片组成），用于研究与细胞的相互作用。
2. 结果发现，在胞吞过程中，MnO2纳米片弯曲、折叠进一步包裹AuNPs，导致LSPR红移，可反映二维纳米材料与细胞膜动态的相互作用。
3. 红移之后的蓝移因依赖于细胞内的还原性物质，所以也可用来研究细胞内局部环境的氧化还原状态。
二维纳米材料与生物医学
近年来，二维纳米材料因其高比表面积和优异的物理化学性质吸引了越来越多关注，在生物传感、生物成像、组织工程及载药等领域均取得了广泛应用。为了更好地在生物医药领域应用二维纳米材料，理解它们与生物组织界面如细胞之间动态的相互作用显得尤其重要。然而，单一的二维纳米材料与生物组织界面相互作用时，缺乏有效的信号输出，极大地限制了相关方面的研究。此外，细胞内的氧化还原状态是评估细胞功能的一个重要参数，而生物系统的复杂性和仪器的局限性使得在单细胞水平上了解细胞内局部氧化还原状态存在挑战。
成果简介
有鉴于此，安徽师大夏云生课题组与南开大学肖乐辉课题组、香港中文大学Jianfang Wang（王建方）课题组合作制备了一种各向异性、二维飞碟状（UFO）AuNP@MnO2 核@壳结构超级纳米粒子（简称为AMNS-SPs，由金纳米球和二维二氧化锰纳米片组成），并在单颗粒水平研究了其与细胞的相互作用。
图文摘要
由于该超级纳米粒子的MnO2纳米片柔软易变形，在囊泡化过程中，MnO2纳米片弯曲、折叠，进一步包裹金核，使其周围折射率增大而发生局域表面等离子共振（LSPR）红移。基于这一设计，实现了纳米材料囊泡化过程的动态、实时监测。实验中，观察到两种不同的囊泡化过程，速率相差约一个数量级。而且，该超级纳米粒子进入细胞后，与胞内的还原性分子（如谷胱甘肽）发生反应（MnO2纳米片被刻蚀），LSPR蓝移。这一现象为在单细胞水平上探索胞内局部环境的氧化还原状态提供了可能。
要点1：UFO形状AMNS-SPs的表征
图1C是AMNS-SPs的高分辨电镜图，测得MnO2纳米片的晶格间距分别为0.24和0.29 nm，与文献报道δ-相MnO2的{-111}和{020}面相对应，可得出MnO2纳米片是多晶结构。图1D和1E是AMNS-SPs的原子力显微镜（AFM）图，测得MnO2纳米片的厚度约为4.2 nm。由于单层MnO2的厚度是0.69-0.72 nm，相应的MnO2纳米片大约是6层。可见，本文中的金球是被直径较大的各向异性二维MnO2纳米片所包裹，形成了单分散性好且结构清晰的飞碟状的AMNS-SPs超级纳米粒子。
图1 UFO形状的AMNS-SPs材料表征。（A）SEM表征；（B）TEM表征；（C）HRTEM表征；（D）AFM表征；（E）高度剖面图。图（F）-（I）分别为不同直径（0，108，151，230 nm）MnO2纳米片修饰的AMNS-SPs TEM表征。（J）不同直径MnO2纳米片修饰的AMNS-SPs的消光光谱。
通过改变AMNS-SPs合成过程中所用KMnO4的量来调控MnO2纳米片的直径（108-230 nm）。随着KMnO4量的增多，MnO2纳米片的直径逐渐增大，同时~380 nm处MnO2特征吸收峰的强度逐渐增大且AuNPs的LSPR逐渐红移。对于研究AMNS-SPs与细胞相互作用，厚度超薄又直径较大的MnO2纳米片是获得LSPR信号变化的关键。所以后续研究选择直径为230 nm的MnO2纳米片修饰的AMNS-SPs，而且细胞实验中AMNS-SPs均被相应的细胞膜包裹。
要点2：AMNS-SPs与细胞的相互作用
随后，AMNS-SPs用于研究与细胞（HepG2和3T3）的相互作用。如图2A所示，经孵育后，HepG2细胞膜上出现了橙色的散射点（源于AMNS-SPs）。选择其中一个颗粒测定其光谱如图2D所示，0-25分钟，该颗粒LSPR光谱（λmax）出现一定程度的波动（597.3±5.8 nm），第26分钟突然从595.9 nm红移至618.4nm，随后逐渐蓝移，第40分钟蓝移至575.3 nm。可见，λmax大致可分为波动（0-25分钟）、红移（26分钟）和蓝移（26-40分钟）三个阶段。
图2 UFO形状的AMNS-SPs与不同活细胞的相互作用。
在第一个阶段，AMNS-SP附着在细胞表面，其位置和方向随时可能改变，使得AuNP周围的折射率发生变化导致LSPR光谱出现波动。在第二个阶段（第26分钟），AMNS-SP可能“找到”合适的位点并通过内吞作用进入细胞。由于MnO2纳米片厚度超薄、直径较大且柔软易变形，因此在胞吞过程中，MnO2纳米片弯曲、折叠，进一步包裹AuNP，使其周围折射率增大导致LSPR红移。随后，本研究用不同的细胞得到了类似的结果，但LSPR红移的速率不同，即观察到两种不同的囊泡化过程，速率相差约一个数量级（图2F-J，2K-O）。
我们进一步用时域有限差分（FDTD）法来研究LSPR的红移。如图3A和3B所示，以AMMS-SPs中的AuNP进一步分别被1、2和3层MnO2纳米片包裹为模型，模拟计算其LSPR分别红移25、40和55 nm，所以用FDTD计算验证了LSPR红移的实验结果。不过模拟计算过程中，AuNP是被完全包裹的，而实验中，变形的MnO2纳米片很难甚至不可能完全包裹AuNP（图2P和2Q）。因此，LSPR红移的实验值应该比计算值略小。
为了进一步说明MnO2纳米片的柔软易变形是细胞囊泡化过程中LSPR红移的关键，本文制备了另一种厚的MnO2纳米片修饰AuNPs的超级纳米粒子（简称为TAMNS-SPs），并在相同条件下研究它们与细胞动态的相互作用。如图3C所示，TAMNS-SPs也是单分散的，并且具有清晰的核壳结构。与图1B相比，TEM图像衬度增加表明MnO2纳米片的厚度增加。经AFM（图3E和3F）测定其厚度约为12 nm。厚度增加导致空间位阻增强，使得MnO2纳米片不能弯曲、折叠进一步包裹AuNP，导致胞吞过程中，TMNS-SP的LSPR没有发生红移（图3J）。
图3 AMNS-SPs与细胞相互作用的FDTD计算（A、B）及对比实验（C-J）。
当AMNS-SPs进入细胞后，LSPR光谱立即发生持续的蓝移，第40分钟蓝移至575.3 nm。为了研究胞内AMNS-SPs囊泡的状态，用预标记了DiO的细胞膜来包裹AMNS-SPs，然后观察它们与HepG2细胞的相互作用。
如图4所示，荧光共聚焦与暗场显微镜图像均显示AMNS-SPs进入了细胞且分布在细胞质中。通过三维共聚焦图像，可以清楚看到DiO分布在细胞质中而不是细胞膜上，说明AMNS-SPs是通过内吞作用而不是细胞膜的融合进入细胞的。如图4E-4H所示，胞内AMNS-SPs囊泡的散射和荧光信号呈现出高度的共定位，说明经胞吞形成的囊泡得到了很好的保留，变形的MnO2纳米片在胞内仍然包裹着AuNP。因此，从第26分钟到第40分钟LSPR的蓝移归因于MnO2纳米片与还原性分子（如谷胱甘肽）反应，即MnO2纳米片被刻蚀。由于胞外的还原性分子可忽略不计，可得出LSPR的蓝移发生在胞内。同时LSPR的蓝移紧紧跟随着LSPR的红移，进一步证实了LSPR的红移源于AMNS-SP的胞吞过程。
图4 AMNS-SPs囊泡的胞内状态。细胞膜用DiO（绿色）标记，细胞核用Hoechst（蓝色）标记。
小结
总的来说，MnO2纳米片由于具有超薄的厚度（4.2 nm）与较大的直径(230 nm)，且柔软易变形，在胞吞过程中，它们弯曲、折叠进一步包裹AuNPs，使其周围的折射率增大导致LSPR红移。由此所构建的LSPR光谱变化是一种便捷且准确的方法用于实时监测二维纳米材料与细胞膜动态的相互作用。而在红移之后的蓝移因依赖于细胞内的还原性物质，所以也可用来研究细胞内局部环境的氧化还原状态。
参考文献：
Yunyun Ling, Di Zhang, Ximin Cui, Meimei Wei, Ting Zhang, Jianfang Wang,Lehui Xiao, Yunsheng Xia. Direct Monitoring Cell Membrane Vesiculation with 2D AuNP@MnO2 Nanosheet Supraparticles at Single‐Particle Level. AngewandteChemie International Edition, 2019.
DOI: 10.1002/anie.201902987
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201902987
作者简介：
夏云生，安徽师范大学教授。主要研究方向为无机纳米粒子自组装在生物分析中的应用以及纳米造影剂与活体成像。国家自然基金委优秀青年科学基金（2014）。
课题组主页：
http://chem.ahnu.edu.cn/info/1166/7496.htm
