用发光能量供体/受体对在生物底物上进行双标记，可设计探针，此探针可提供FRET读数以检测相互作用对象。然而，共价结合的发光体会产生空间位阻和非特异性相互作用，这可能会扰乱生物识别。在此，南京邮电大学赵强、Kenneth Yin Zhang等人设计了一种高灵敏度和特异性的“识别后标记”传感方法，其中发光体标记发生在生物识别之后。以切割酶caspase-3为例，其中四肽基序Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)为可切割底物，铱(Ⅲ)络合物和罗丹明衍生物为能量供体/受体对，研究了caspase-3在溶液和凋亡细胞中的催化活性。在DEVD四肽的氨基和羧基末端分别修饰了叠氮化物和GK-降冰片烯，通过两个独立的无催化生物正交反应实现了供体/受体的双标记。由于罗丹明衍生物的胞内FRET，铱(Ⅲ)络合物的磷光寿命在双标记时被猝灭，并且短肽被caspase-3催化裂解时其磷光寿命显著延长。有趣的是，在“识别后标记”传感方法中，寿命响应的灵敏度和效率要高得多。分子对接分析表明，空间位阻和非特异性相互作用部分抑制了caspase-3对DEVD底物的生物识别。光致发光寿命成像显微镜显示了caspase-3在凋亡细胞中的催化活性。寿命分析不仅证实了细胞内生物正交双标记和催化裂解的发生，而且还能显示了两个动态过程发生的程度。

Qi Wu, Kenneth Yin Zhang, Peiling Da, et al. Bioorthogonal “Labeling after Recognition” Affording an FRET-Based Luminescent Probe for Detecting and Imaging Caspase-3 via Photoluminescence Lifetime Imaging. J. Am. Chem. Soc., 2019.

https://doi.org/10.1021/jacs.9b12191