杨扬教授&刘鹏教授，今年已发表了一篇Nature，两篇Nature Chemistry，一篇Nature Synthesis不对称催化去芳基化能够将平面的芳基化合物转化为立体结构明确的三维分子结构的有效方法学，有鉴于此，加州大学圣巴巴拉分校杨扬教授、匹斯堡大学刘鹏教授等报道发展了一种新型（new-to-nature）金属催化-生物催化体系，实现了酶催化以自由基方式进行不对称去芳构化。在这项工作中，作者使用定向进化的技术得到新型自由基去芳构化酶P450rad1-P450rad5，实现了对广泛的芳基化合物进行不对称去芳构化，反应兼容的底物包括吲哚、吡咯、酚等，反应能够以立体汇聚的方式和立体发散的方式进行自由基去芳构化，得到优异的酶催化控制能力。理论计算研究发现工程化的金属酶与反应中间体之间的氢键相互作用对于增强酶催化活性和立体选择性的重要作用。此外，作者发现非离子表面活性剂能够显著促进生物转化反应速率，为生物转化反应效率低的问题提供了解决方案。图2. 金属氧化还原-酶不对称催化杂环芳烃自由基脱芳构化由于吲哚杂环化合物广泛应用于医药、农药、功能材料等领域，因此作者对生物催化吲哚自由基脱芳构化进行研究。使用α-溴酰胺修饰的吲哚1a作为反应物，测试了以往工作中进行工程化设计的CYP102A1变体（P450BM3）和工程化的P450自由基环化酶的催化活性。使用96孔板以高通量实验的方式以携带P450变体的完整大肠杆菌细胞进行生物催化性能的初筛。筛选发现许多变体能够生成去芳构化的螺环结构产物2a，这种产物含有相邻的四级碳原子，但是大多数反应的产物是消旋的。比如，P450自由基环化酶P450ATRCase1和P450arc1能够分别以35 %和38 %的产率生成2a，产物的立体选择性为53:47 e.r.。随后，作者惊喜的发现之前发现的卡宾转移酶P411-VACtrans（P1）能够以34 %的产率和53:47 e.r.立体选择性2a产物。而且进一步作者发现，当加入抗坏血酸钠，在没有细胞的方式下进行酶催化能够得到类似的产率，同时得到提高的立体选择性（83:17 e.r.）。 使用P1作为起始，随后通过酶定向进化的方式改善P450自由基脱芳构酶的立体选择性和催化活性。通过AutoDock软件进行分子对接实验，并且对关键的活性位点基团进行靶向设计，进行迭代位点诱变和筛选。在每轮次的定向进化过程中，得到4种酶的分子库，使用96孔板进行测试和筛选。筛选后发现三个有益的突变，L181V, A78C, F437A，得到 P411-CIS A78C V87L L181V P248T I263G F437A酶，将这些酶命名为P450rad1。整个细胞形式的生物催化剂P450rad1的催化活性改善了2倍，立体选择性显著得到增强，得到82 %的产率和91:9 e.r.立体选择性。当不在细胞内的P450rad1作为酶催化剂，能够以90 %的产率和97:3 e.r.的立体选择性生成2a。使用这种吲哚脱芳构化酶P450rad1研究反应兼容的吲哚底物分子。在5位点含有供电子官能团的吲哚，比如甲氧基（2a）、甲基（2b）具有非常好的反应性，得到优异的产率和立体选择性。反应同样能够兼容一些缺电子的官能团，比如氟（2d）、氯（2e）、溴（2f）。而且对于2、4、5、6、7位点含有取代基的吲哚都能够非常好的进行脱芳构化转化（2g-2j）。其中，修饰4-甲基（2g）和7-甲基的反应物同样得到优异的立体选择性，但是由于位阻效应导致产率有些减少。对于4-甲基吲哚（2g），使用变体 P1 A78C L181V (P450rad1 A437F)能够得到比P450rad1稍微更高的立体选择性（95:5 e.r.）。吡咯立体发散脱芳构酶P450rad2和P450rad3 图3.P450rad1，P450rad2，P450rad3的发现，进化，底物兼容性开发的金属酶催化体系能够应用于吡咯d氨杂环化合物的自由基脱芳构化。其中P411-CIS L75A L181A能够以93 %的产率和85:15 e.r.立体选择性生成(R)-4a，P411Diane2 W263I G268A P327T V328A能够以93 %的产率和10:90 e.r.立体选择性生成(S)-4a。随后通过诱变和筛选，得到的 P450rad2和P450rad3 具有更好的立体选择性，分别能够生成94 %的产率和91:9 e.r.的(R)-4a，以76 %的产率和8:92 e.r.立体选择性生成(S)-4a。其中P450rad3的TON达到3230±10。作者进一步拓展了生物催化自由基脱芳构化反应对电子富集的芳烃兼容。特别关注2-溴-1,3-双羰基化合物(5)的自由基脱芳构化。因为该反应能够生成含有两个连续四级碳立体中心位点的产物。通过对 P450arc1 L266H G438T L78C (‘P2’)进行诱变和筛选，得到P450rad4，能够以98 %的产率和94:6 e.r.立体选择性将5a转化为6a，实现了非常罕见的对应汇聚自由基脱芳构化转化的方法。P450rad4能够对许多酚化合物进行对应汇聚自由基脱芳构化，比如没有修饰取代基的苯酚（5b），2,6双官能团取代的苯酚（5a, 5c），修饰酯基（乙基酯(6a-6c)、丙基酯(6d)、丁基酯(6e)）的苯酚。使用起始的P2变体进行立体选择性催化转化，能够以45 %的收率和78:22 e.r.立体选择性生成立体结构拥挤并含有相邻四级碳-四级碳的3,5-二甲基修饰的苯酚，能够以55 %的产率和81:19 d.r.和84:16 e.r.立体选择性生成6g产物。作者发现胶束效应能够显著的加快难以溶解于水溶液的萘酚底物的生物催化转化反应动力学。作者设想底物在水中的溶解性较低时导致生物催化反应动力学缓慢的原因，而不是酶催化剂活性导致。验证发现，当使用混合溶剂，能够改善产率，并且稍微增强立体选择性。但是这种混合溶剂无法进一步改善反应。作者认为胶束催化剂能够为溶解性提供普适性的解决方案，因为纳米胶束的疏水内核为疏水底物提供非常好的反应环境，因此显著增加有效浓度。因此，通过选取合适的表面活性剂，能够维持金属酶的完整性和催化活性。同时，非离子性表面活性剂能够避免蛋白质变形，因此非离子性表面活性剂是较好的选择。随后选取6个非离子性表面活性剂，发现端基修饰羟基官能团（Brij 30, Brij 35, TPGS-1000）具有比端基甲氧基官能团（Nok, TPGS-750-M）更高的转化率和产率。而且这种加入表面活性剂的方法能够将酶催化反应在没有细胞裂解物的状态进行，从而能够改善产率和立体选择性。 总之，这项研究非常罕见的展示胶束能够加快生物催化反应动力学，这说明选择合适的表面活性剂有助于生物催化转化转化反应。这项技术有可能应用于其他具有底物溶解性问题的生物催化转化。刘鹏，本科毕业于北京大学，硕士毕业于加拿大圭尔夫大学，博士毕业于UCLA，现为匹兹堡大学副教授。刘鹏课题组使用计算工具来研究有机和有机金属反应。研究反应的发生方式，控制速率和选择性的因素，并提供理论见解，以帮助开发改进催化剂和试剂。杨扬，2011年在北京大学获得化学学士学位，师从王剑波教授进行本科研究。随后，他在麻省理工学院获得有机化学博士学位，师从Stephen Buchwald教授。在麻省理工学院，他的研究重点是铜催化的简单烯烃的不对称水官能团化。作为美国国立卫生研究院博士后研究员，杨博士与加州理工学院的Frances Arnold教授（2018年诺贝尔化学奖得主）合作，开发了一种C(sp3)-H键不对称胺化的通用酶催化平台，目前是美国加州大学圣巴巴拉分校教授。杨扬教授曾获得摄政青年教师奖学金（2021年）、教师职业发展奖（2022年）、NSF职业奖（2022年）、美国国立卫生研究院最大化研究者研究奖（2022年）、蒂姆化学期刊奖（2023年）、陆军研究办公室青年研究员奖（2023年）、帕卡德奖学金（2023年）和斯隆研究奖学金（2024年）。Fu, W., Fu, Y., Zhao, Y. et al. A metalloenzyme platform for catalytic asymmetric radical dearomatization. Nat. Chem. (2024). DOI: 10.1038/s41557-024-01608-8https://www.nature.com/articles/s41557-024-01608-8 Wang, TC., Mai, B.K., Zhang, Z. et al. Stereoselective amino acid synthesis by photobiocatalytic oxidative coupling. Nature 629, 98–104 (2024).DOI:10.1038/s41586-024-07284-5https://www.nature.com/articles/s41586-024-07284-5Ju, S., Li, D., Mai, B.K. et al. Stereodivergent photobiocatalytic radical cyclization through the repurposing and directed evolution of fatty acid photodecarboxylases. Nat. Chem. 16, 1339–1347 (2024).DOI: 10.1038/s41557-024-01494-0https://www.nature.com/articles/s41557-024-01494-0Zhao, LP., Mai, B.K., Cheng, L. et al. Biocatalytic enantioselective C(sp3)–H fluorination enabled by directed evolution of non-haem iron enzymes. Nat. Synth 3, 967–975 (2024).DOI: 10.1038/s44160-024-00536-2https://www.nature.com/articles/s44160-024-00536-2
